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    公开号:WO1992009627A1
    申请号:PCT/JP1991/001648
    申请日:1991-11-29
    公开日:1992-06-11
    发明作者:Atsushi Isoai；Yuko Hama；Hiromichi Kumagai
    申请人:Asahi Glass Company Ltd.；
    IPC主号:C07K14-00
    专利说明:
    [0001] 曰月 糸田 β
    [0002] 癌細胞浸潤阻害活性ペプチド、 ペプチド複合体、 及び癌転移抑制剤
    [0003] [産業上の利用分野]
    [0004] 本発明は、 癌細胞浸潤阻害活性を有する新規なペプチド、 癌細胞浸潤阻害活 'ト生 を有するペプチドと高分子との複合体、 及びそれらを有効成分として含む癌耘移 抑制剤に関するものである。
    [0005] [背景技術]
    [0006] 癌の治療には主として外科的療法、 放射線および化学療法が行われている。 し かし、 癌の再発、 転移の点では満足すべき治療効果を挙げられていない。 現在用 いられている多くの制癌剤は、 核酸や蛋白質の生合成系を阻害することによって 癌細胞を死に至らしめるものである。 しかしながら、 これら制癌剤の作 ¾におい ては正常細胞と癌細胞は区別されず、 そのため正常細胞に対する作用により副作 用が生じ易いという大きな問題があった。
    [0007] また、 これらの制癌剤は原発巣を縮小させ治療するものであった。 しかし、 癌 の治療において常に問題になっていたことは癌細胞の転移であった。 即ち、 癌細 胞が原発巣から離れて他の臓器に転移し、 そこで増殖することにより致命的な結 果を招いていた。 従って、 癌の棂本的治療のために、 癌細胞の増殖抑制とともに 浸潤転移に対して有効な抑制効杲を示す制癌剤の開発が望まれている。
    [0008] 癌転移の機構としては多くの研究がなされ、 耘移の抑制に関する物質の検索も 広くなされてきた。 癌細胞は、 原発巣から遊離した後血管中に侵入する。 そして 癌細胞は、 血管壁に接着後血管内皮細胞層の下に潜り込み、 細胞外基質を破壊し て標的臓器の実質中に浸潤侵入する。 このようにして癌細胞は他の臓器に転移す ると考えられている (L. A. Liotta et al. , Lab. Invest. , 49, 636-649, (1983) )。 癌転移抑制剤開発のためには、 上に示した各ステップの何れかを抑制するもの が開発されればよいと考えられる。 例えば、 癌細胞が細胞外基質と接着するのを 阻害するもの （例えば、 Ν.丄 Humphries et al. , Science, 223, 467-470, (1986) ) , 中皮細胞層下や血管内皮細胞層下への浸潤を阻害する物質 （例えば、 Isoai et al. , Jpn. J. Cancer Res. , 81 , 909-914, (1990) ) 、 細胞外基質の分解を阻害する物 質 （例えば、 R. M. Schultz et al. , Cancer Res. , 48, 5539-5545, (1988) ) 、 等が挙 げられる。
    [0009] [発明の開示]
    [0010] 本発明者らは、 このような状況に鑑み、 癌細胞の浸潤を阻害する物質について 鋭意研^ を重ねた。 特に、 本発明者らの発明にかかわる上記癌細胞の浸潤を阻害 する物質 （後記式 （14) のアミノ酸配列で表わされるペプチド） の改良、 並びに その活性や安定性の向上を検討した。 その結果、 アミノ酸残基数がより少ない新 規なぺプチドを見いだすとともに、 癌細胞の浸潤を阻害するべプチドを担体に担 持することによりその活性が向上ししかも生体内での安定性が向上することを見 いだした。
    [0011] 本発明は、 後記式 （1)〜（13)で表わされるいずれかのアミノ酸配列を有するぺ プチドのような、 癌細胞浸潤阻害活性を有するァミノ酸残基数 5〜20のべプチド ならびにそれらの酸付加塩に関する発明である。
    [0012] 癌細胞浸潤阻害活性を有するアミノ酸残基数 5〜20のべプチドとしては、 下記 式 （1)~ (13)で表わされるいずれかのアミノ酸配列を有するぺプチドが好まし い。
    [0013] (1) Ala-Glx-Lys-Ala-Glx-Gly
    [0014] (2) Ala-Glx-Lys-Ala-Glx-Gly-Ala
    [0015] (3) Ala-Glx-Lys-Ala-Glx-Gly-Ala-Gly
    [0016] (4) Ala-Glx-Lys-Ala-Glx-Gly-Ala-Gly-Asx
    [0017] (o)Ala-Glx-Lys-Ala-Glx-Gly-Ala-Gly-Asx-Ala
    [0018] (6) Ala-Glx-Lys-Ala-Glx-Gly-Ala-Gly-Asx-Ala-Lys
    [0019] (7) Asx-Ala-Lys-Thr-Asx-Glx-Ala-Glx-Lys-Ala-Glx-Gly
    [0020] (8) Ala-Lys-Thr-Asx-Glx-Ala-Glx-Lys-Ala-Glx-Gly
    [0021] (9) Lys-Thr-Asx-Glx-Ala-Glx-Lys-Ala-Glx-Gly
    [0022] (10) Thr-Asx-Glx-Ala-Glx-Lys-Ala-Glx-Gly
    [0023] (11) Asx-Glx-Ala-Glx-Lys-Ala-Glx-Gly
    [0024] (12) Glx-Ala-Glx-Lys-Ala-Glx-Gly
    [0025] (13) Asx-Glx-Ala-Glx-Lys-Ala
    [0026] (ただし、 式中、 Glxは Gliiあるいは Ginを表わし、 Asxは Asnあるいは Aspを 表わす。 ）
    [0027] 上記式 （1)から（13)で示される配列のペプチド [以下、 それぞれを 「式 （1)ぺ プチド」 〜 「式（13)ペプチド」 という] は、 それ自身で浸潤阻害活性ならびに転 移阻害活性 [以下、 これらの活性を、 特に言及しない限り、 浸潤阻害活性と総称 する〗 を有する。 このペプチドは浸潤阻害活性を有することにより、 癌細胞の転 移を抑制する効果を有し、 それゆえに癌転移抑制剤として有用なぺプチドであ る。
    [0028] また、 前記本発明者らが既に文献に発表したペプチドは下記（14)で表わされる アミノ酸配列を有するペプチド [以下、 「式（14)ペプチド」 という] である。 (14) Ala-Glu-Asp-Gly-Asp-Ala-Lys-Thr-Asp-Glx-Ala-Glx-Lys-Ala-Glu-Gly-Ala- Gly-Asp-Ala-Lys
    [0029] (ただし、 式中、 Glxは Gluあるいは Ginを表わす。 ）
    [0030] 本発明は、 また、 癌細胞浸潤阻害活性を有するペプチドを本質的に無毒の高分 子担体に担持してなるぺプチド複合体に関する発明である。 癌細胞浸潤阻害活性 を有するペプチドとしては、 上記式 （1)〜（14)で示されるペプチドから選ばれる 少なくとも 1種のペプチドが好ましい。 本質的に無毒の高分子担体としては、 生 体由来の高分子が好ましく、 ペプチドをこれに担持なるとは、 両者を化学的に結 合してなることが好ましい。 このべプチド複合体は前記べプチドと同様癌転移抑 制剤として有用である。
    [0031] このペプチド複合体は、 これら単独ペプチドに比較して、 浸潤阻害活性の向上 及び生体内での安定性向上の面でより優れている。
    [0032] 本発明における高分子担体としては、 種々のものを使用できる。 この高分子担 体としては、 生体由来の高分子が好ましい。 しかし、 医薬として許容し得る合成 高分子や合成蛋白質などの合成高分子であつてもよい。 生体由来の高分子として は、 生体由来の蛋白質が好ましいが、 これのみに限られず、 例えば生体由来の多 糖類であってもよい。 生体由来の蛋白質以外で好ましい生体由来の高分子は、 コ ンドロイチン硫酸とヒアルロン酸である。
    [0033] 生体由来の蛋白質としては、 利用可能であればいかなるものであってもよい 力 望ましくは、 血中での安定性が高く、 安価でかつ大量に入手できるものがよ レ、。 例えば、 血獎成分であるプレアルブミン、 アルブミン、 アルファ一グロブリ ンタンパク、 ベ一タグロブリンタンパク、 ィムノグロブリンタンパク、 アンチ卜 ロンビン、 補体タンパク、 フイブリノ一ゲン、 フイブロネクチン、 コラーゲン、 などが挙げられる。 また、 医薬として許容し得る酵素タンパクであってもよい。 蛋白質の由来は、 望ましくはヒト由来であるが、 その他の動物由来であっても よい。 特に好ましい生体由来の蛋白質は、 上記のようなアルブミン類やグロプリ ン類である。
    [0034] ぺプチド -蛋白質複合体において、 蛋白質 1分子当たり結合したべプチドの数 は 1分子以上であり、 特に 1〜： L0分子程度が好ましい。
    [0035] コンドロィチン硫酸あるいはヒアルロン酸としては、 種々のものを使用でき る。 特に生体に対して好ましくない影響を与えることのないコンドロイチン硫酸 あるいはヒアルロン酸が用いられる。 コンドロイチン硫酸としては、 市販のもの は勿論、 軟骨、 結合組織等の生体から抽出された各種コンドロイチン硫酸を使用 できる。 ヒアルロン酸としても同様に、 市販のものは勿論、 鶴の鶏冠等の生体か ら抽出された各種ヒアルロン酸を使用できる。 これら両者の分子量は特に限定さ れるものではないが、 数万程度以上の分子量を有するものが適当である。
    [0036] ペプチド一 （コンドロイチン硫酸あるいはヒアルロン酸） 複合体におい-て、 結 合しているペプチドの量は特に限定.されるものではなく、 目的に応じて結合量を 調節することができる。 例えば、 これに限定されるものではないが、 複合体 l mg 当たり結合しているべプチドの量は 1 ~1000 )Li g程度が適当であり、 特に 10〜 500 μ g程度が好ましい。
    [0037] 本発明の複合体はペプチドと蛋白質等とを化学的に結合させてなるものである こと力 S好ましい。 しかし、 吸着などの物理的結合であってもよい。 化学的結合の 様式としては、 カルボジイミド縮合法、 臭化シアン活性化法（Axen k Ernback (1971) Eur. J. Biochem. ; i8, 351) 、 または、 プロトン化シッフ塩基に続くイソシ アン化合物との反応によるリアレンジメント（Ugi) 反応（Axen et al.， Acta Chem. Scand. , 25, 1129 (1971) )等により得られる共有結合等が挙げられる。 かかる結合手段の適用に当たっては、 水系で反応することを求められる物質の 縮合に適用する水溶性カルポジイミドを用いる方法、 多糖類の化学的修飾、 活性 化を経て蛋白、 ペプチド等を高分子担体に結合せしめる固定化酵素、 ァフィニテ ィ一クロマト担体調製等の技術を適応した方法などを使用することができる。 本発明において特に好ましい上記結合の手段は、 カルポジイミ ド縮合法であ る。 これに用いるカルポジイミド類としては、 例えば、 下記のカルポジイミド類 が挙げることができる。 カルポジイミド類としては、 特に水溶性のカルポジイミ ド類が好ましい。
    [0038] ジェチルカルボジイミド、 ジイソプロピルカルポジイミド、 メチルプロピル力 ルボジイミド、 ジシクロ口へキシルカルポジイミド、 へキサメチレンカルボジィ ミ ド、 ヘプタメチレンカルポジイミ ド、 1-ェチル -3- (3-ジメチルァミノプロピ ル） カルポジイミド、 1-シクロへキシル -3- (2-モルホリノエチル） カルポジイミ ドメソ -P- トルエンスルホネート、 1-t-ブチル -3- (3-ジメチルァミノプロピル） カルポジイミド、 ジフエ二ルカルポジイミド、 4，4 ' - ジニトロジフエ二ルカルボ ジイミド、 ジ -P- トリカルポジイミド、 ビス （トリメチルシリル） カルポジイミ ド'。
    [0039] 具体的な複合体の製法としては、 前記種々の方法に応じて適宜採用しうる。 例 えば、 水溶性カルポジイミドによる縮合法では、 蛋白質とその 1-60当量の式 （1) 〜（13)ペプチドのいずれかとを水性溶媒に溶解し、 11を7. 5〜8. 5 付近に調整 し、 蛋白質に対して重量にして等量程度の水溶性カルポジイミドを添加して反応 を行う方法を採用することができる。 この方法により容易に本発明のぺプチドー 蛋白質複合体が得られる。 得られた複合体は、 透析、 アルコール沈殿、 ゲル濾 過、 イオン交換、 逆相クロマトグラフィー等により精製することが好ましい。 本発明において、 癌細胞浸潤阻害物質の探索方法としては、 例えば、 明渡らに より開発された系 (Cancer Res. , 46, 2416-2422, (1986) ) , または、 Albiniらの系 (Cancer Res. , 47, 3239-3245, (1987) )が可能である。
    [0040] 明渡らの方法は、 初代培養により得たラット中皮細胞シートの上に、 高浸潤性 の浮遊細胞を添加し 20-40 時間後に、 中皮細胞シートの下に潜り込んだ癌細胞の 数を測定する方法である。
    [0041] Albiniらの方法は、 8 μの穴があいたポリカーボネート製のフィルターで上下 2層からなるトランスウエルチヤンバー （ボイ'デンチヤンバーの改良型） を用い ら
    [0042] る方法である。 この方法では、 フィルタ一の上面に 50 Atのマトリゲル （コラボレ 一テブ社製） を塗布し乾燥させ、 下層には走化性因子どしてフイブロネクチンな どの細胞外基質の成分を入れ、 上層に転移性癌細胞を加え、 20-40 時間後フィル タ一の下面に移動した癌細胞の数を計測する。
    [0043] 本発明において、 動物を用いた癌転移評価としては、 通常用いられている実験 的肺転移系を用いる。 即ち、 B16 メラノーマやルイス肺癌などの転移性癌細胞を マウス尾静脈に注射し、 2-3週間後に肺を摘出し、 肺表面に見える転移巣の数を 数えることで癌転移を評価する。
    [0044] このようにして、 本発明の式 （1)ペプチド〜式（13)ペプチド、 及び式 （1)ぺプ チド〜式（14)ペプチドから選ばれる少なくとも 1種のペプチドと生体由来の高分 子とを化学的に結合してなるぺプチド複合体は、 強い癌細胞浸潤阻害活性および 癌転移阻害活性を示し、 癌転移抑制剤として有望であることが確認された。
    [0045] [図面の簡単な説明]
    [0046] 第 1図〜第 4図は、 下記の実施例 Cおよび E - 3において本発明のぺプチドゃ ペプチド複合体の癌細胞浸潤阻害効果を Albiniらの方法で測定した結果を示すグ ラフである。 第 5図は下記の実施例 E— 4において本発明のぺプチドゃぺプチド 複合体の血中動態を測定した結果を示すグラフである。
    [0047] [癸明を実施するための最良の形態]
    [0048] 本発明について以下実施例をあげて説明する。 なお、 ペプチドを表わすために 用いた略号は次の意味を有する。
    [0049] Ala:ァラニン、 Glu:グルタミン酸、 Gin:グルタミン、 Glx:グルタミン酸またはグ ル夕ミン、 Asp :ァスパラギン酸、 Asn:ァスパラギン、 Asx:ァスパラギン酸または ァスパラギン、 Gly:グリシン、 Lys:リジン、 Thr:スレオニン。
    [0050] 実施例 A [ペプチドの合成]
    [0051] Merrifieldの固相合成によりペプチド合成を行った。 即ち、 目的とするぺブ チドをミリジェン社製自動合成機モデル 9050によって合成した。 次いで、 合成 したペプチドを高速液体クロマトグラフィー （HPLC) で次のような精製条件で 精製した。
    [0052] カラム： ウォーターズ社製 C18カラム、 マイクロボンダスフエアー C18力 ラム （1.9 Xl5cm、 粒子直径 5 Atm)
    [0053] 溶出液 A： 0.1 %トリフルォロ酢酸を含む水
    [0054] 溶出液 B : 0.1 %トリフルォロ酢酸を含むァセトニトリル
    [0055] 流 速： 10ml/min 0から 30分の間に溶出液 Bを 0から 40%まで直線濃度 勾配をかけ溶出させた。
    [0056] 溶出させたペプチドを回収しこれを凍結乾燥し、 精製されたべプチドを得 た。
    [0057] 次に、 得られたペプチドの一部をアミノ酸分析に供し、 そのアミノ酸組成 (残基数ノモル） を測定した。 。
    [0058] 分 析： 6N塩酸中、 110eCで 24時間真空中で完全に加水分解
    [0059] また、 ウォーターズ社製逆相カラム、 マイクロボンダスフヱァ一 C18 カラ ム （0.39xl5cm) を使用し、 HPLCシステムにて分析し、 目的としたペプチド の純度を測定した。
    [0060] 以上の方法により下記のペプチドを合成し、 分析した。 精製条件等の変更 と、 合成結果を示す。
    [0061] 実施例 A - 1
    [0062] 式（7) ペプチド [Asp-Ala-Lys-Thr-Asp-Gln-Ala-Glu-Lys-Ala-Glu-Gly ] の合 成。
    [0063] アミノ酸組成： Asx: 2.04 Ala:2.93 Lys:2.03 Thr:0.89 Glx:3.02
    [0064] Gly:1.01
    [0065] ぺプチド純度： 99%以上
    [0066] 実施例 A - 2
    [0067] 式（6) ペプチド [Ala-Glu-Lys-Ala-Glu-Gly- Ala-Gly-Asp-Ala-Lys ] の合成。
    [0068] アミノ酸組成： Asx: 0.98 Ala:4.11 Lys:1.97 Glx:2.01 Gly:2.08 ぺプチド純度： 99%以上
    [0069] 実施例 A - 3
    [0070] 式（13)ペプチド [Asp-Gln-Ala-Glu-Lys-Ala ] の合成。
    [0071] 変更点； HPLCによる精製において、 溶出液 Bの直線濃度勾配を 0から 30% までとした。 アミノ酸組成： Asx: 1.05 Ala :1.99 Lysrl.Ol Glx:2.01 ペプチド純度： 99%以上
    [0072] 実施例 A - 4
    [0073] 式（9) ペプチド （Lys-Thr-Asp-Gln-Ala-Glu-Lys-Ala-Glu_Gly ) の合成。
    [0074] アミノ酸組成： Asx: 0.98 Ala:2.10 Lys:2.01 Glx:3.01 Gly:1.01
    [0075] Thr:0.91
    [0076] ぺプチド純度： 99%以上
    [0077] 実施例 B [合成べプチドによる癌細胞浸潤阻害効果]
    [0078] 実施例 Aで作製したぺプチドについて癌細胞の浸潤阻害効果を調べた。 評価 方法は下記の Albiniらの方法に従って行つた。
    [0079] 8 Aimのボアサイズを持つボリカーボネートフィルタ一により、 上層と下層 に分けられたケモタキセル （クラボウ社製） のフィルター上面を 50 gのマト リゲル （コラボレーティブ社製） を塗布し、 室温で一晚乾燥させた。 使用直前 に培養液で膨潤させ、 24穴のカルチャープレートにセットした。 癌細胞は B16 メラノーマ由来の高転移性クローン B16FE 7 を使用した。 細胞を 2 /xCi/mlの [3H] チミジン存在下で 2日間培養した。 使用直前に卜リブシン溶液で細胞を 回収した後、 0.1 %の牛アルブミンを含む培養液に懸濁し、 細胞数と取り込ま れた [3H] チミジンの放射能活性を計測した。
    [0080] ケモタキセルの下層には 20w g/mlのヒトフイブロネクチンを入れ、 上層に は 5 X104 の細胞を種々の濃度のペプチドと共に入れ、 C02 インキュベータ中 で 20時間培養した。 培養終了後、 フィルタ一の上面に残っている細胞を綿棒で かきとり、 フィルタ一とティッシュソルピライザ一 （アマシャム社製） で、 下 面に移動した細胞と共に溶解した後、 放射能を計測した。
    [0081] ぺプチドとして下記のぺプチドを使用した結果を第 1図〜第 3図に示す。 式（7) ペプチド：第 1図
    [0082] 式（6) ペプチド：第 2図
    [0083] 式（13)ペプチド：第 3図
    [0084] 実施例 C [合成べプチドによる癌細胞転移抑制効果]
    [0085] 実施例 Aで作成したペプチドについて癌細胞の転移に対する抑制効果を調べ た
    [0086] C 57BL/6J マウス （7週令、 雌） 一匹当たり 1.2 X105 個 （可変） の高転移 性マウス癌細胞 B16FE 7を、 種々の濃度の本合成ペプチドを尾静脈から注射し た。 2週間後マウスを殺し、 肺を摘出して肺表面上の転移巣の数を、 実体顕微 鏡下で計測した。
    [0087] その結果を、 マゥス一匹当たり注射した癌細胞数とぺブチドの種類とともに 第 1表〜第 3表に示す。
    [0088] 第 1表 式（7) ペプチドの癌転移に及ぼす効果
    [0089] (癌細胞数： 1.2 X105 個） ぺプチド 肺 表 面 上 の 平 均 土
    [0090] 重 （Atg/ 転 移 巣 の 数
    [0091] マウス）
    [0092] 0 27, 30， 32， 66, 68， 72 49.2±8.8
    [0093] 100 17,20,22,27,32,44 27.0±4.0
    [0094] 300 19, 21， 30， 31， 38， 39 29.7±3.4
    [0095] I D
    [0096] 第 2表 式 (6) ペプチドの癌転移に及ぼす効果
    [0097] (癌細胞数： 1. 5 X 105 個）
    [0098]
    [0099] 第 3表 式（13)ペプチドの癌転移に及ぼす効果
    [0100] (癌細胞数： 1. 2 105 個）
    [0101] 参考例 [式（14)ぺプチドの合成]
    [0102] 式（14)ぺプチド [Ala-Glu-Asp-Gly-Asp-Ala-Lys-Thr-Asp-Glx-Ala-Glx- Lys- Ala-Gl -Gly-Ala-Gly-Asp-Ala-Lys 〗 の合成
    [0103] 実施例 Aと同様に標記べプチドをミリジユン社製自動合成機モデル 9050によ つて合成しだ。
    [0104] 次いで、 これを高速液体クロマトグラフィー （HPLC) で次のような条件で精
    [0105] ¾した o カラム： ウォーターズ社製 C18カラム、 マイクロボンダスフエア一 C18力 ラム （1. 9 x l5cm、 粒子直径 5 At m )
    [0106] 溶出液 A ： 0. 1 %トリフルォロ酢酸を含む水
    [0107] 溶出液 B ： 0. 1 %トリフルォロ酢酸を含むァセトニトリル
    [0108] 流 速： 10ml/min 0から 30分の間に Bを 0から 60%まで直線濃度勾配 をかけ溶 させる。
    [0109] 溶出させたぺプチドを回収しこれを凍結乾燥に供した。
    [0110] 分 析： 6N塩酸中、 11CTCで 24時間真空中で完全に加水分解し、 アミノ酸 分析に供した。
    [0111] また、 その一部をウォーターズ社製逆相カラム、 マイクロボンダスフヱァ一 C 18カラム（ 0. 39 X 15 cm)を使用し、 高速液体クロマトグラフィー装置により 分析した結果、 本ペプチド以外の不純物は全く見出されず、 したがって、 合成 した本べプチドの純度は 99%以上であった。
    [0112] 実施例 D [式（14)ぺブチド複合体の作製]
    [0113] 実施例 D - 1
    [0114] 式（14)ベプチド -血清アルブミン複合体の作製
    [0115] 参考例で作製した式（14)ペプチドを水溶性カルポジイミドによる縮合反応に より、 マウス血清アルブミンに結合させた。
    [0116] 参考例で作製した式（14)ペプチド 100 mgとマウス血清アルブミン 100 mgを 10 cm3の蒸留水に溶解せしめ、 1 Nの水酸化ナトリウム溶液で pHを 8. 5 に調整し た。 この溶液に 100 mg/cm3の 1-ェチル -3- (3-ジメチルァミノプロピル） カルボ ジイミ ド溶液を l cm3 加え、 混合物を 37°Cで 2時間、 次いで 4でで 12時間反応 させた。 1 Mのグリシン溶液を加えることで反応を終了させ、 ついで、 蒸留水 5, 000 cm3 に対して透析した。 得られた溶液を高速液体クロマトグラフィー （ 逆相クロマト） に供し、 複合体を精製した。 精製条件は、 参考例と同様であ り、 ペプチド一マウス血清アルブミン複合体は、 未反応またはペプチド同士の 複合体よりさらに遅れて溶出され、 これらは、 完全に分離できた。
    [0117] 溶出させた複合体を凍結乾燥にかけた。 得られた複合体の量は、 90 mgであ つた。 精製した複合体を SDS-ポリアクリルアミ ド電気泳動により分析した結 I
    [0118] 果、.複合体以外の不純物は見出されなかった。 マウス血清アルブミンの分子量 は約 67， 000であるが、 上記の結合反応によりベプチドが結合し、 平均分子量が 74， 000に変化した。 このことは、 マウス血清アルブミン 1分子に対し、 ぺプチ ドが平均 2. 5分子結合したことを示している。
    [0119] 実施例 D - 2 . ；
    [0120] [ 1 4C] 標識複合体の作製
    [0121] 実施例 D— 1で作製した式（14)ベプチドー血清アルブミン複合体を還元メチ ル化反応 (Jen toft & Dearborn, Methods in Enzymology, 91, 57G, (1983) ) に より [14C] で標識した。
    [0122] 0. 15M塩化ナトリウムを含む 10mMリン酸緩衝液 (PBS) に、 実施例 D— 1で 作製したぺプチド一血清アルブミン複合体を 8 mgん m3の濃度になるように溶解 せしめ、 その 0. 5cm3に 0. 1Mの NaBH3CN を 0. 025cm3を加え、 さらに、 10 /x Ciの [14C] ホルムアルデヒド （アマシャム社製： 477MBq/cm3) を加え、 4。Cで 20時 間反応させた。 反応終了後、 PBS を加えセントリコン 1 0 (アミコン社製） を 用い、 脱塩濃縮を繰返した。 標識体には、 1735 cpπl /μ gの[ "C] が取込まれ た （ cpm ;カウント Z分） 。
    [0123] 標識体を SDS-PAGEで分析した結果、 非標識の複合体と同じ挙動を示し、 ま た、 同等の癌細胞浸潤阻害活性を示した。
    [0124] 実施例 D - 3
    [0125] ペプチド一 IgG複合体の作製
    [0126] 参考例で作製した式（14)ぺプチドを水溶性カルボジィミドによる縮合反応に より、 マウス IgG に結合させた。
    [0127] 参考例で作製した式（14)ペプチド 20 mg とマウス IgG 20 mg を 1 cm3 の蒸留 水に溶解せしめ、 1 Nの水酸化ナトリゥム水溶液で pHを 8. 5 に調整した。 この 溶液に 100 nig/cm3 の 1-ェチル -3- (3-ジメチルァミノプロピル） カルポジイミ ド溶液を 0. 1 cm3 を加え、 混合物を 37°Cで 2時間、 次いで 4 °Cで 12時間反応さ せた。 1 Mのグリシン溶液を加えることで反応を終了させ、 ついで、 蒸留水 3, 000 cm3 に対して透析した後凍結乾燥に供し、 15 mgの複合体を得た。
    [0128] 実施例 E [ペプチド複合体の癌細胞浸潤阻害効果、 転移抑制効果] 実施例 E - 1
    [0129] ぺプチド-血清アルブミン複合体の癌細胞浸潤阻害活性測定
    [0130] 実施例 D— 1で作製したぺプチド-血清アルブミン複合体について癌細胞の 浸潤抑制効果を調べた。 評価方法は実施例 Bの Albiniらの方法に従い、 そのべ プチドの代りにこのペプチド複合体を使用した。
    [0131] その結果を第 4図に示す。 本複合体により、 癌細胞の浸潤が有意に阻害され ることが示された。
    [0132] 実施例 E - 2
    [0133] ぺプチドおよびべプチド-血清アルブミン複合体の血中動態測定
    [0134] 参考例で作製した式（14)ペプチド、 および実施例 D— 2で作製した [ "C] 標 識複合体の血中動態を検討した。
    [0135] C57BL/6jマウス （8週令、 雌） の尾静脈に、 Ι, ΟΟΟ μ ε Ζ 0. 2cm3 のべプチ ドまたは、 ΙΟΟ μ εΖ 0. 2cm3 の標識複合体を注射した。 一定時間後に、 頸動 脈を切断し採血を行なった。 血中のペプチド量を定量する場合は、 採取した 1 cm3 の血液に等量の 10%トリフルォロ酢酸を加え、 10， 000回転ノ分の遠心で変 性蛋白を沈殿させ、 上清を回収した。 この沈殿に 1. 5cm3の 10%トリフルォロ酢 酸を加えよく撹拌した後、 遠心し上清を回収し、 先に得た上清と合わせ、 凍 乾燥に供した。 得られた凍結乾燥品に 0. 2cm3 の蒸留水を加え、 逆相 （C 18) クロマトグラフィーにより定量した。 定量は標準品 （アミノ酸分析で定量した 参考例で作製したべプチド） で得られた定量曲線をもとに行なった。
    [0136] [ 1 4C] 標識複合体を定量する場合は、 採取した血液 0. 2cm3に 2. 5cm3のテイツ シュソルビライザ一 （NCA ;アマシャム社製） を加え、 50°Cで 2時間加熱し血液 を可溶化させた。 これに 30%過酸化水素水を 0. 2cm3加え、 50eCで更に 1時間加 熱し溶液を脱色した。 室温まで冷却させた後、 15cm3 の液体シチレーシヨン力 クテルを加え、 液体シンチレ一シヨンカウンタ一により、 [ 1 4C] の放射能を計 測した。
    [0137] その結果、 第 5図に示すように、 ペプチドの血中半減期は約 20秒で、 3分程 度で血中から消失してしまったが、 ぺブチドー血清アルブミン複合体の血中消 失曲線は 2相性になり、 60分経っても 40%程度の複合体が残っていることが明 らかとなつた。 ぺプチド一アルブミン複合体の血中での半減期が大幅に延長し たことから、 作用の持続が期待できる。
    [0138] 実施例 Ε - 3
    [0139] ぺプチド複合体の癌転移抑制効果
    [0140] 実施例 D— 1で作製したペプチド一血清アルブミン複合体、 および実施例！ 一 3で作製したペプチド一 igG複合体について、 実施例 Cの方法で癌細胞の転 移に対する抑制効果を調べた。 その結果を第 4表と第 5表に示す。
    [0141] 表 4 式（14)ベプチドー血清アルブミン複合体の癌転移に及ぼす効果
    [0142] (癌細胞数： 1.5 X105 個） 複合体量 肺表面上の 平均値 ±標準誤差
    [0143] ( gZマウス） 転移巣の数
    [0144] 0 54, 56,105,121,129，
    [0145] 248,310,387 176.3 土 43.7
    [0146] 220 49， 53, 77， 75， 84,
    [0147] 103,142,157 91.8 土 14.0
    [0148] 670 50， 57， 58， 59, 61,
    [0149] 62,158 72.1 士 U.4
    [0150] 2000 3, 5,13,18,29,
    [0151] 36, 58 23.1 土 7.4
    [0152] 第 5表 式（14)ぺプチド - IgG複合体の癌転移に及ぼす効果
    [0153] (癌細胞数： 1. 0 X 105 個）
    [0154]
    [0155] 実施例 F [ぺプチド-血清アルブミン複合体の作製]
    [0156] 実施例 F - 1
    [0157] 式（7) ペプチド一血清アルブミン複合体 (i) の作製
    [0158] 実施例 A— 1で作製した式 (7) ペプチドを、 実施例 D— 1と同じ方法で水溶 性カルポジイミ ドによる縮合反応を行い、 マウス血清アルブミンに結合させ た。 得られた複合体の量は、 90mgであった。
    [0159] 精製した複合体を S D S—ポリアクリルアミ ド電気泳動により分析した結 果、 複合体以外の不純物は見出されなかった。 マウス血清アルブミンの分子量 は 66000でり、 上記の結合反応によりペプチドが結合し、 平均分子量が 69000 に変化した。 このことは、 マウス血清アルブミン 1分子に対し、 式（7) ベプチ ドが平均 2. 5分子結合したことを示している。
    [0160] 実施例 F - 2
    [0161] 式（6) ペプチド一血清アルブミン複合体 (ii)の作製
    [0162] 実施例 A— 2で作製した式 (6) ペプチドを実施例 F— 1と同様に水溶性カル ポジイミドによる縮合反応により、 マウスアルブミンに結合させた。 式（6) ぺ プチドーアルブミン複合体の収量は、 81mgであり、 アルブミン 1分子に対し平 均 3. 1分子の式（6) ペプチドが結合していた。
    [0163] 実施例 F - 3
    [0164] 式（9) ペプチド一血清アルブミン複合体（iii) の作製 (6
    [0165] 実施例 A— 4で作製した式（9) ペプチドを実施例 F— 1と同様に水溶性カル ポジイミドにより複合体を作製した。 複合体の収量は 84mgであり、 アルブミン 1分子につき式 (9) ペプチドが平均 2. 8分子が結合していた。
    [0166] 実施例 F - 4
    [0167] 式（13)ぺプチドー血清アルブミン複合体（iv)の作製
    [0168] 実施例 A— 3で作製した式（13)ぺブチドを実施例 F— 1と同様に水溶性力ル ポジイミド法によりアルブミンと結合させた。 収量は 91mgであった。 アルブミ ン 1分子につき、 式（13)ペプチドは平均 5. 2分子結合していた。
    [0169] 実施例 G [ぺプチド複合体の癌細胞浸潤阻害効果]
    [0170] ぺプチド一血清アルブミン複合体 （i)〜(iv)の癌細胞浸潤阻害活性測定 実施例 F— 1〜F - 4で作製したぺプチドー血清アルブミン複合体について 癌細胞の浸潤阻害効果を調べた a 評価方法は、 実施例 Bの Albiniらの方法に従 つて、 そのペプチドの代りにこのペプチド複合体を使用して行った。 その結果 を第 6表に示す。
    [0171] 第 6表 ぺプチド複合体の癌転移に及ぼす効果
    [0172]
    [0173] 実施例 H [ぺプチド複合体の癌転移抑制効果]
    [0174] ぺプチドー血清アルブミン複合体 （i)〜（iv)の癌転移抑制活性
    [0175] 実施例 F— 1〜F— 4で作 |¾したペプチド複合体について、 実施例 Cの方法 で癌細胞の転移に対する抑制効果を調べた。 結果を第 7表に示す。 '7
    [0176] 表 7 ペプチド一血清アルブミン複合体 （i) ' (iv)の癌転移に及ぼす効果
    [0177] (癌細胞数： 1. 5 X 105 個）
    [0178]
    [0179] 実施例 I [式（14)ぺプチド複合体の作製]
    [0180] 実施例 I一 1
    [0181] ぺプチドーコンドロイチン硫酸複合体の作製
    [0182] 参考例で作製した式（14)ぺプチドを水溶性力ルポジィミドによる縮合反応に より、 牛気管由来のコンドロイチン硫酸 （シグマ社製） に結合させた。
    [0183] コンドロイチン硫酸 lOOmgを蒸留水 2 cm3 に溶解し、 この溶液に最終濃度 70 mMになるように 1-ェチル -3- (3-ジメチルアミノブ口ピル） カルポジイミドを加 え、 室温で 30分反応させた。 この反応液に 10mgの式 （ 1 ) ペプチドを加え、 室 温でさらに 20時間反応させた。 これに、 3倍量のメタノールを加えて複合体を 沈殿させた。
    [0184] 沈殿物を遠心で回収し、 これに蒸留水を加え、 溶解させた後、 蒸留水 5000 cm3 に対して透析を 5回繰返した。 得られた複合体を高速液体クロマトグラフ ィー （ゲルろ過） に供し、 未反応の式（14)ペプチドが残存していないことを確 認した。 得られた複合体の量は、 79mgであった。 この一部をアミノ酸分析に供 した結果、 複合体 l mg当り、 63 t g のペプチドが結合している事が判明した。 実施例 I一 2
    [0185] ぺプチドーヒアルロン酸複合体の作製 参考例 1で作製した式（14)ぺプチドを水溶性力ルポジイミドによる縮合反応 により、 牛気管由来のヒアルロン酸 （シグマ社製） に結合させた。
    [0186] l cm3 の 10mMリン酸緩衝液 （pH7.4 ) に lOmgのヒアルロン酸を溶解させ、 こ れに最終濃度 70mMになるように、 1-ェチル -3- (3-ジメチルァミノプロピル） 力 ルボジイミドを加え、 30分室温で反応させた。 これに、 lOmgの式（14)ペプチド を加え、 さらに、 室温で 20時間反応させた。 これに、 3倍量のメタノールを加 え、 複合体を沈殿させた。
    [0187] 遠心で沈殿物を回収し、 これを、 蒸留水に溶解させた後、 蒸留水 5000cm3 に 対して透析を 5回繰返した。 得られた複合体を高速液体クロマトグラフィー （ ゲルろ過） に供し、 未反応の式（14)プチドが残存していないことを確認した。 得られた複合体の量は、 6.4 mgであった。 この一部をアミノ酸分析に供した結 果、 複合体 l mg当り、 190 t gのペプチドが結合している事が判明した。
    [0188] 実施例 J [ペプチド複合体の癌転移抑制効果]
    [0189] ぺプチド-コンドロイチン硫酸複合体の癌転移抑制活性試験
    [0190] 実施例 I一 1で作製した式（14)ペプチドーコンドロイチン硫酸複合体につい て、 実施例 Cの方法で癌細胞の転移に対する抑制効果を調べた。 結果を第 8表 に示す。
    [0191] 第 8表 ぺプチドーコンドロイチン硫酸複合体の癌転移に及ぼす効杲
    [0192] (癌細胞数： 1. 5 105 個） 複合体量 （ mg/マウス） 肺表面上の転移巣の数 平均値土標準誤差
    [0193] 0 35, 142, 164, 190, 342 174. 6 ± 49. 5
    [0194] 10 16, 38， 43, 62， 68 45.4 ± 9. 2
    权利要求:
    Claims 請 求 の 範 囲 . 癌細胞浸潤阻害活性を有するァミノ酸残基数 5〜20のべプチドならびにそれ らの酸付加塩。. 癌細胞浸潤阻害活性を有するペプチドが、 下記式 （ 1 ) ないし （13) のいず れかで表わされるアミノ酸配列を有するぺプチドである、 請求の範囲第 1項記 載のぺプチドならびにそれらの酸付加塩。 (1) Ala-Glx-Lys-Ala-Glx-Gly (2) Ala-Glx-Lys-Ala-Glx-Gly-Ala (3) Ala-Glx-Lys-Ala-Glx-Gly-Ala-Gly (4) Ala-Glx-Lys-Ala-Glx-Gly-Ala-Gly-Asx (5) Ala-Glx-Lys-Ala-Glx-Gly-Ala-Gly-Asx-Ala (6) Ala-Glx-Lys-Ala-Glx-Gly-Ala-Gly-Asx-Ala-Lys (7) Asx-Ala-Lys-Thr-Asx-Glx-Ala-Glx-Lys-Ala-Glx-Gly (8) Ala-Lys-Thr-Asx-Glx-Ala-Glx-Lys-Ala-Glx-Gly (9) Lys-Thr-Asx-Glx-Ala-Glx-Lys-Ala-Glx-Gly (10) Thr-Asx-Glx-Ala-Glx-Lys-Ala-Glx-Gly (11) Asx-Glx-Ala-Glx-Lys-Ala-Glx-Gly _ -(12) Glx-Ala-Glx-Lys-Ala-Glx.-Gly (13) Asx-Glx-Ala-Glx-Lys-Ala (ただし、 式中、 Glxは Gluあるいは Ginを表わし、 Asxは Asnあるいは Aspを表わす。 ） . 癌細胞浸潤阻害活性を有するァミノ酸残基数 5〜20のべプチドならびにそれ らの酸付加塩を有効成分とする癌転移抑制剤。. 癌細胞浸潤阻害活性を有するペプチドが、 下記式 （1 ) ないし （13) のいず れかで表わされるアミノ酸配列を有するぺブチドである、 請求の範囲第 3項記 載の癌転移抑制剤。 (1) Ala-Glx-Lys-Ala-Glx-Gly (2) Ala-Glx-Lys-Ala-Glx-Gly-Ala (3) Ala-Glx-Lys-Ala-Glx-Gly-Ala-Gly ZD (4) Ala-Glx-Lys-Ala-Glx-Gly-Ala-Gly-Asx (5) Ala-Glx-Lys-Ala-Glx-Gly-Ala-Gly-Asx-Ala (6) Ala-Glx-Lys-Ala-Glx-Gly-Ala-Gly-Asx-Ala-Lys (7) Asx-Ala-Lys-Thr-Asx- Glx-Al a- Glx-Lys-Ala- Glx- Gly (8) Ala-Lys-Thr-Asx-Glx-Ala-Glx-Lys-Ala-Glx-Gly (9) Lys-Thr-Asx-Glx-Ala-Glx-Lys-Ala-Glx-Gly (10) Thr-Asx-Glx-Ala-Glx-Lys-Ala-Glx-Gly (11) Asx-Glx-Ala-Glx-Lys-Ala-Glx-Gly (12) Glx-Ala-Glx-Lys-Ala-Glx-Gly (13) Asx-Glx-Ala-Glx-Lys-Ala (ただし、 式中、 Glxは Gluあるいは Ginを表わし、 Asxは Asnあるいは Aspを表わす。 ） . 癌細胞浸潤阻害活性を有するぺプチドを本質的に無毒の高分子担体に担持し てなる、 ペプチド複合体。 - 癌細胞浸潤阻害活性を有するぺプチドと生体由来の高分子とを化学的に結合 してなるペプチド複合体。. 癌細胞浸潤阻害活性を有するペプチドが、 下記式 （1 ) ないし （14) のいず れかで表わされるアミノ酸配列を有するペプチドである、 請求の範囲第 5項ま たは第 6項記載のぺプチド複合体。
    (1) Ala-Glx-Lys-Ala-Glx-Gly
    (2) Ala-GIx-Lys-Ala-Glx-Gly-Ala
    (3) Ala-Glx-Lys-Ala-Glx-Gly-Ala-Gly
    (4) Ala - Glx - Lys - Ala - Glx - Gly - Ala - Gly - Asx
    (5) Ala-Glx-Lys-Ala-Glx-Gly-Ala-Gly-Asx-Ala
    (6) Ala-Glx-Lys-Ala-Glx-Gly-Ala-Gly-Asx-Ala-Lys
    (7) Asx-Ala-Lys-Thr-Asx-Glx-Ala-Glx-Lys-Ala-Glx-Gly
    (8) Ala-Lys-Thr-Asx-Glx-Ala-Glx-Lys-Ala-Glx-Gly
    (9 ) Lys-Thr-Asx-Glx-Ala-Glx-Lys-Ala-Glx-Gly
    (10) Thr-Asx-Glx-Ala-Glx-Lys-Ala-Glx-Gly I
    (11) Asx-Glx-Ala-Glx-Lys-Ala-Glx-Gly
    (12) Glx-Ala-Glx-Lys-Ala-Glx-Gly
    (13) Asx-Glx-Ala-Glx-Lys-Ala
    (14) Ala-Glu-Asp-Gly-Asp-Ala-Lys-Thr-Asp-Glx-Ala-Glx-Lys-Ala-Glu-Gly- Ala-Gly-Asp-Ala-Lys
    (ただし、 式中、 Glxは Gluあるいは Ginを表わし、 Asxは Asnあるいは Aspを表わす。 )
    . 生体由来の高分子が蛋白質である、 請求の範囲第 6項記載のペプチド複合 体。
    . 蛋白質がアルブミンあるいはグロブリンである、 請求の範囲第 8項記載のぺ プチド複合体。
    0 . 生体由来の高分子がコンドロイチン硫酸あるいはヒアルロン酸である、 請 求の範囲第 6項記載のぺプチド複合体。
    1 . 化学的に結合する手段がカルポジイミド縮合法である、 請求の範囲第 6項 記載のぺプチド複合体。
    2 . 請求の範囲第 5項〜第 1 1項のいずれかのペプチド複合体を有効成分とす る癌転移抑制剤。
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    EP0513388A1|1992-11-19|
    EP0513388A4|1993-06-30|
    EP0671412A1|1995-09-13|
    CA2074945A1|1992-05-31|
    US5548062A|1996-08-20|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1992-06-11| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): CA US |
    1992-06-11| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FR GB GR IT LU NL SE |
    1992-07-29| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 2074945 Country of ref document: CA Ref document number: 1991920819 Country of ref document: EP |
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    1997-09-16| WWW| Wipo information: withdrawn in national office|Ref document number: 1991920819 Country of ref document: EP |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    JP2/330612||1990-11-30||
    JP2330612A|JP2975100B2|1990-11-30|1990-11-30|新規ペプチドおよびその用途|
    JP3035260A|JP2917548B2|1991-02-05|1991-02-05|ペプチド複合体、及びそれを有効成分とする癌転移阻害剤|
    JP3/35260||1991-02-05||
    JP3/91306||1991-03-29||
    JP3091306A|JPH04300900A|1991-03-29|1991-03-29|Peptide conjugate and cancer metastasis inhibitor containing the same as active component|
    JP3/91305||1991-03-29||
    JP3091305A|JPH04300899A|1991-03-29|1991-03-29|Peptide conjugate and cancer metastasis inhibitor|US08/157,437| US5548062A|1990-11-30|1993-11-26|Tumor cell invasion-inhibiting peptides, peptide complexes and cancer metastasis inhibitors|
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